霍乱弧菌

霍乱弧菌
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。
霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。

简介
弧菌属(Vibrio)中霍乱弧菌(V．cholerae)、引起一种烈性肠道传染病，发病急、传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。
霍乱弧菌包括两个生物型：古典生物型（Classical biotype）和埃尔托生物型（EL-Tor bio-type）。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来，全球共发生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍乱弧菌，第七次病原是埃尔托型所致。
1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株。

性状
形态与培养特性
新从病人分离出古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌比较典型，为革兰氏阴性菌，菌体弯曲呈弧状或逗点状，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为活泼，呈流星穿梭运动。在液体培养基内常呈单个、成对成链状，有的相连呈S形，甚至螺旋状。
营养要求不高，在PH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因其他细菌在这一PH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。
霍乱弧菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，靛基质反应阳性，当培养在含硝酸盐及色氨酸的培养基中，产生靛基质与亚硝酸盐，在浓硫酸存在时，生成红色，称为霍乱红反应，但其他非致病性弧菌亦有此反应，故不能凭此鉴定霍乱弧菌。EL Tor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同。前者Vp阳性而后者为阴性。前者能产生强烈的溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，古典型霍乱弧菌则不溶解羊红细胞。个别EL Tor型霍乱弧菌株亦不溶血。
抗原性
根据弧菌O抗原不同，分成Ⅵ个血清群，第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型：含AC者为原型（又称稻叶型），含AB者为异型（又称小川型），A、B、C均有者称中间型（彦岛型）。
抵抗力
霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱，EL-Tor生物型抵抗力较强，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鲜鱼，贝壳类食物上存活1～2周。
霍乱弧菌对热，干燥，日光，化学消毒剂和酸均很敏感，耐低温，耐碱。湿热55℃，15分钟，100℃，1～2分钟，水中加0.5ppm氯15分钟可被杀死。0.1%高锰酸钾浸泡蔬菜、水果可达到消毒目的。在正常胃酸中仅生存4分钟。

检测方法
生化鉴定
能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等产酸产气，迟缓发酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水杨素、卫矛醇、鼠李糖、木糖、侧金盏花醇和肌醇。氧化酶、明胶液化试验阳性。V-P试验大多数EL-Tor生物型阳性，而古典生物型大多为阴性。霍乱弧菌能分解色氨酸产生吲哚，同时能还原硝酸盐为亚硝酸盐。因此当霍乱弧菌培养在含硝酸盐的蛋白胨水中，所产生的亚硝酸盐与吲哚结合成亚硝基吲哚，滴加浓硫酸即出现蔷薇色，称为霍乱红试验阳性。
血清凝集法
根据弧菌O抗原不同，分成Ⅵ个血清群，第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型：含AC者为原型（又称稻叶型），含AB者为异型（又称小川型），A、B、C均有者称中间型（彦岛型）。
1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株，推荐使用天津生物芯片生产的霍乱弧菌诊断血清。
聚合酶链反应法
1,普通聚合酶链反应法
核酸扩增技术，即聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。一般选择霍乱肠毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作为靶基因。一些非产毒株(如环境来源的菌株)有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表达调控基因(toxR)等也被选用为PcR的靶基因，这大大提高了检测的特异度.
2 ,多重PCR法
与常规PCR相比，多重PCR一次反应可检测多个基因，节省了时间和成本。国内、外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、tcp与其他基因如ompW、rfb、hly进行组合，作为共同的靶基因，克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重PcR同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株，可谓一举多得，大大提高了检测效率。
3.荧光定量PCR法
荧光定量PCR自动化程度高、特异性强、无交叉污染，在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来，随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光PCR仪的开发与广泛使用，多重荧光定量PCR技术日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为应用的热点.
基因芯片
与PCR方法相比，基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息，从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析，对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。但基因芯片成本较高，距离推广应用尚需时间等待。

症状
人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌，此为本病典型的特征。
霍乱肠毒素本质是蛋白质，不耐热，56℃经30分钟，即可破坏其活性。对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素，具有很强的抗原性。现已能将该毒素高度精制成晶状，仍保持极强的生物学活性。霍乱肠毒素致病机理如下：毒素由A和B两个亚单位组成，A亚单位又分为A1和A2两个肽链，两者依靠二硫链连接。A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体。1个毒素分子由一个A亚单位和4~6个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A精致单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内 cAMP浓度增高，导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡。
致病因素
霍乱弧菌产生肠毒素，是一种剧烈的致泄毒素。该毒素作用于肠壁促使肠黏膜细胞极度分泌从而使水和盐过量排出，导致严重脱水虚脱；进而引起代谢性酸中毒和急性肾功能衰竭 。
所致疾病
引起烈性肠道传染病霍乱，为我国的甲类法定传染病。在自然情况下，人类是霍乱弧菌的唯一易感者。在地方性流行区，除病人外，无症状感染者也是重要传染源。高比例的无症状携带者有利于疾病的扩散，根据卫生状况，无症状携带者和病人的比率波动在10:1～100:1之间。
传播途径主要是通过污染的水源或未煮熟的食物如海产品、蔬菜经口摄入。居住拥挤，卫生状况差，特别是公用水源是造成暴发流行的重要因素。人与人之间的直接传播不常见。在正常胃酸条件下，如以水为载体，需饮入大于1010个细菌方能引起感染；如以食物作为载体，由于食物高强度的缓冲能力，感染剂量可减少到102～104个细菌。任何能降低胃中酸度的药物或其他原因，都可使人对霍乱弧菌感染的敏感性增加。
病菌到达小肠后，粘附于肠粘膜表面并迅速繁殖，不侵入肠上皮细胞和肠腺，细菌在繁殖过程中产生肠毒素而致病。O1群霍乱弧菌感染可从无症状或轻型腹泻到严重的致死性腹泻。在古典生物型霍乱弧菌感染中，无症状者可达60%，在El Tor生物型感染中，无症状者可达75%。霍乱弧菌古典生物型所致疾病较El Tor生物型严重。典型病例一般在吞食细菌后2～3天突然出现剧烈腹泻和呕吐，多无腹痛，每天大便数次或数十次。在疾病最严重时，每小时失水量可高达1升，排出由粘膜、上皮细胞和大量弧菌构成的如米泔水样的腹泻物。由于大量水分和电解质丧失而导致失水，代谢性酸中毒，低碱血症和低容量性休克及心力不齐和肾衰竭，如未经治疗处理，病人可在12～24小时内死亡，死亡率高达25%～60%，但若及时给病人补充液体及电解质，死亡率可小于1%。O139群霍乱弧菌感染比O1群严重，表现为严重脱水和高死亡率，且成人病例所占比例较高，大于70%，而O1群霍乱弧菌流行高峰期，儿童病例约占60%。
病愈后一些患者可短期带菌，一般不超过3～4周，真正的慢性带菌者罕见。病菌主要存在于胆囊中。
免疫性
患过霍乱的人可获得牢固的免疫力，再感染者少见。病人在发病数日，血液中即可出现特异性抗体，7℃14天抗体滴度达高峰，随后逐渐下降至较低水平，但能持续约3个月之外。病后小肠内可出现分泌型lgA。体液抗体与免疫的关系尚不清楚，一般认为局部SlgA可在肠粘膜与病菌之间形成免疫屏障，有阻断粘附和中和毒素的作用。

诊断
由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检
采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养
可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验
取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验
除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。

特征
霍乱弧菌所致的霍乱，为烈性肠道传染病，曾在世界上发生过几次大流行，至今仍未平息，因此，霍乱被列为国境检疫的传染病。
霍乱弧菌有两个生物型，一为古典生物型，一为爱尔托生物型，这两个生物型在形态及血清学性状方面几乎相同，可作第四组霍乱噬菌体裂解试验，多粘菌素B敏感试验，鸡红细胞凝集试验，V-P(服-泼)二氏试验等试验加以鉴别：
本菌是需氧菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好。霍乱弧菌具有耐碱性，故常用碱性(pH值8.4～9.2)培养基选择性分离培养本菌。在碱性琼脂平板上生长后，呈水滴样光滑型菌落，而在碱性蛋白胨液体培养基中，生长迅速，培养6～8小时即可形成菌膜，利用这一特点，可以作快速增菌，进行鉴定。在庆大霉素琼脂平板上，生长快，8～10小时能生长出小菌落，可供鉴定用。霍乱弧菌能分解蔗糖、甘露醇，产酸不产气，不能分解阿拉伯胶糖。
霍乱弧菌在未经处理的粪便中，可存活数天；在冰箱内的牛奶、鲜肉和鱼虾水产品中存活时间分别为2～4周、1周和1～3周；在室温下存放的新鲜蔬菜中，可存活1～5天；在砧板和布上可存活相当长时间；在玻璃、瓷器、塑料和金属上存活时间不超过2天。霍乱弧菌古典生物型在外界环境中生存能力不强，而爱尔托生物型抵抗力较强，在河水、井水、池塘水和海水中可存活1～3周，甚至更长，有时在局部自然水中也能越冬。爱尔托生物型弧菌可粘附于海洋甲壳类生物表面，分泌甲壳酶，分解甲壳作为营养而长期存活，如爱尔托生物型弧菌被人工饲养的泥鳅、鳝鱼吞食后，可在其体内生长繁殖，然后排入水中。
霍乱弧菌对热、干燥、日光及一般消毒剂均很敏感，经干燥2小时或加热55℃10分钟即可死亡，煮沸立即死亡；对酸敏感，在正常胃酸中仅能存活4分钟，接触1∶5000～1∶10000盐酸或硫酸、1∶2000～1∶3000升汞或1∶500000高锰酸钾，数分钟即被杀灭，在0.1%漂白粉中10分钟内即可死亡。氯化钠的浓度高于4%或蔗糖浓度在5%以上的食物、香料、醋及酒等，均不利于霍乱弧菌的生存。

发病机制
正常胃酸可杀灭霍乱弧菌，当胃酸分泌缺乏或低下，或入侵的霍乱弧菌数量较多，未被杀灭的弧菌就进入小肠，在碱性肠液内迅速繁殖，并通过粘液对细菌的趋化吸引作用、细菌鞭毛活动及弧菌粘蛋白溶解酶和粘附素等的作用，粘附于小肠粘膜的上皮细胞表面，并在此大量繁殖。
此菌产生强烈的外毒素，即霍乱肠毒素，由A亚单位和B亚单位组成。B亚单位与该处粘膜上皮细胞表面受体——神经节苷脂结合，A、B两种亚单位解离，A亚单位穿过细胞膜进入细胞内，激活腺苷酸环化酶(AC)，使细胞内三磷酸腺苷(ATP)转化为环磷酸腺苷(cAMP)，使细胞内环磷酸腺苷含量提高，促使一系列酶反应加速进行，导致空肠到回肠部腺细胞分泌功能亢进，引起大量液体及血浆中的钠、钾、氯等离子进入肠腔，由于分泌功能超过肠道再吸收能力，从而造成严重的腹泻及呕吐；由于胆汁分泌减少，且肠腔中有大量水、粘液及电解质，故排泻物呈白色“米泔水”样；由于剧烈吐泻，导致脱水和电解质丢失，引起缺钾、缺钠及肌肉痉挛；由于碳酸氢根离子丢失，酸性代谢物在体内蓄积，引起代谢性酸中毒；由于有效血容量急剧减少，血液浓缩，导致尿量减少、血压下降，甚至休克；由于肾缺血、缺氧，细胞内缺钾，导致肾小管上皮细胞变性、坏死，造成急性肾功能衰竭。
主要病变均由严重脱水引起，临床可见指纹皱缩，皮下组织及肌肉干瘪。心、肝、脾等脏器均见缩小。内脏浆膜无光泽。肠腔高度扩张、肠内充满泔水样液体，肠粘膜松弛，但粘膜上皮完整，无溃疡。胆囊内充满粘稠胆汁。肾小球及间质的毛细管扩张，肾小管肿胀、变性及坏死。其他脏器也有出血、变性等变化。

防治原则
必须贯彻预防为主的方针，作好对外交往及入口的检疫工作，严防本菌传入，此外应加强水、粪管理，注意饮食卫生。对病人要严格隔离，必要时实行疫区封锁，以免疾病扩散蔓延。
人群的菌苗预防接种，可获良好效果，用加热或化学药品杀死的古典型霍乱菌苗皮下接种，能降低发病率。这种苗菌对EL-Tor型霍乱弧菌感染也有保护作用，但持续时间短，仅3-6个月。口服rBS/WC疫苗（重组B亚单位/霍乱菌体疫苗）可用于预防霍乱，2000年WHO关于霍乱疫苗的意见书提出，“应考虑对有罹患霍乱危险性的人群使用rBS/WC疫苗”。该疫苗对霍乱的保护期为3年，国内有上海联合赛尔生物工程有限公司生产rBS/WC疫苗。
治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌药物如链霉素、氯霉素、强力霉素、复方SMZ-TMP等。