主要依靠流行病学史（发病前2-3周有与腮腺炎患者接触史或当地有本病流行）、腮腺和／或邻近腺体肿大，或伴有睾丸炎、卵巢炎、脑炎等临床症状（详见临床表现部分）作出临床诊断，但确诊或对非典型或亚临床型感染的诊断，必须通过血清学和病原学检查。
1．近年来大多采用ELISA法检测患者急性期血清中有否抗腮腺炎病毒特异性1gM抗体，以期做到早期快速诊断。
2．以EL1SA法检测患者的双分血清（间隔24周），抗腮腺炎病毒特异性IgG抗体有4倍或4倍以上增高者，判断为阳性。
3．在发病早期采取患者唾液或尿液、脑脊液、血液标本，及时接种鸡胚或人胚肾等敏感细胞，进行病毒分离试验，病毒分离阳性标本常用红细胞吸附抑制试验或血凝抑制试验鉴定其是否为腮腺炎病毒。
临床诊断结合1.急性期血清中特异性IgM抗体阳性(前提是1个月内未接种过腮腺炎减毒活疫苗），或2．双分血清特异性IgG抗体效价有4倍或4倍以上增高，或3．腮腺炎病毒分离阳性。即可做出确诊。
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